超薄切片技術(shù)簡介
一、超薄切片前的準(zhǔn)備工作 1．修塊 一般用手工對包埋塊進(jìn)行修整。將包埋塊夾在特制的夾持器上，放在解剖顯微鏡下，用鋒利的刀片先削去表面的包埋劑，露出組織，然后在組織的四周以和水平面成45度的角度削去包埋劑，修成錐體形。 2．半薄切片定位 利用超薄切片機切厚度為1μm-5μm的切片，稱半薄切片。將切下的片子用鑷子或小毛刷轉(zhuǎn)移到干凈的事先滴有蒸餾水的載玻片上，加溫，使切片展平，干燥后經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡觀察定位。如果半薄切片做得好，比一般石蠟切片更能觀察到細(xì)微結(jié)構(gòu)，效果比石蠟切片要好一些。 半薄切片進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察的目的：(1) 定位：通過光學(xué)顯微鏡觀察，確定所要觀察的范圍，然后保留要用電鏡觀察的部分，修去其余部分。(2)便于對同一組織的同一部位進(jìn)行光學(xué)顯微鏡和電鏡的對比觀察。半薄切片定位以后，要對包埋塊作進(jìn)一步的修整。通常將塊的頂端修成金字塔形，頂面修成梯形或長方形(最好是梯形)，每邊的長度為0.2mm～0.3mm。 3．制刀 超薄切片使用的刀有兩種：一種是玻璃刀，另一種是鉆石刀。由于玻璃刀價格便宜，使用者較多。制刀用的玻璃為硬質(zhì)玻璃，有一定的規(guī)格，厚度為5mm～6.5mm。 玻璃刀用專用制刀機制作。制好玻璃刀后，要圍繞刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有樹膠水槽和膠布水槽兩種。樹膠水槽有固定的形狀，可反復(fù)使用。膠布水槽是臨時用膠布或?qū)Ｓ盟芰蠗l制作的。裝好水槽后，用熔化的石蠟封固接口，防止漏水。 4．載網(wǎng)和支持膜 4.1 載網(wǎng) 電鏡中使用的載網(wǎng)有銅網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)、鎳網(wǎng)等，一般常用銅網(wǎng)。載網(wǎng)為圓形，直徑3mm。網(wǎng)孔的形狀有圓形、方形、單孔形等。網(wǎng)孔的數(shù)目不等，有100、200、300目等多種規(guī)格，可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。 4.2 支持膜的制備 挑選并清洗好載網(wǎng)之后，要在載網(wǎng)上覆蓋一層薄膜，這層薄膜稱支持膜，厚度為10nm～20nm。對支持膜的要求是透明無結(jié)構(gòu)，并能承受電子束的轟擊。常用的支持膜有火棉膠膜及聚乙烯醇縮甲醛膜(Formvar膜)，一般采用后者。 二、超薄切片需用超薄切片機進(jìn)行。根據(jù)推進(jìn)原理不同，將超薄切片機分為兩大類：一類是機械推進(jìn)式切片機，用微動螺旋和微動杠桿來提供微小推進(jìn)；另一類是熱脹冷縮式切片機，利用金屬桿熱脹或冷縮時產(chǎn)生的微小長度變化來提供推進(jìn)。 超薄切片的步驟包括：(1)安裝包埋塊；(2)安裝玻璃刀；(3)調(diào)節(jié)刀與組織塊的距離；(4)調(diào)節(jié)水槽液面高度與燈光位置；(5)調(diào)節(jié)加熱電流及切片速度，切片；(6)將切片撈在有支持膜的載網(wǎng)上。
